一例人狂犬病病例的病毒分離和系統(tǒng)鑒定
摘要：
目的 對(duì)2013年武漢市新發(fā)生的一例疑似狂犬病死亡病例的人腦組織進(jìn)行病毒分離及鑒定。
方法 采用直接熒光抗體法（DFA）及ELISA法檢測(cè)狂犬病毒（rabiesvirus，RABV）抗原；提取病毒RNA，設(shè)計(jì)12對(duì)引物，分段擴(kuò)增全基因組，克隆后測(cè)序，應(yīng)用DNASTAR軟件包中的MegAlign模塊對(duì)基因所編碼的氨基酸進(jìn)行對(duì)位分析；Clustal X 1.83軟件和GENEDOC軟件用于序列比對(duì)；Mega4.1軟件以Kimuratwo-parameter模型鄰位相連法（Neighbor-Joining,NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（Bootstrap-1000），并與國(guó)內(nèi)外疫苗株及近期湖北省及周邊地區(qū)分離的代表性街毒株進(jìn)行同源性分析。
結(jié)果 分離的街毒株13WH10的RABV抗原呈陽(yáng)性；13WH10街毒株基因組全長(zhǎng)11,924bp，屬基因Ⅰ型狂犬病毒；13WH10與湖北省及周邊街毒株處于同一亞群，與CTN-1疫苗株及東南亞地區(qū)的街毒株同源性較高，高于歐美國(guó)家疫苗株。
結(jié)論 成功對(duì)武漢市2013年新發(fā)生的一例疑似狂犬病死亡病例的人腦組織進(jìn)行病毒分離及鑒定；CTN-1與RABV國(guó)內(nèi)分離株同源性較高，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近，提示采用CTN-1疫苗株生產(chǎn)的狂犬病疫苗可有效預(yù)防中國(guó)狂犬病的流行。
關(guān)鍵詞：狂犬病毒；街毒株；同源性分析
狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus, RABV）引起的人獸共患性傳染病，病死率幾乎為100%。我國(guó)屬狂犬病高發(fā)國(guó)家，家犬是RABV的主要宿主和傳染源[1]。目前國(guó)內(nèi)分離的人源狂犬病病毒街毒株數(shù)量較少[2-3]，其中僅Ming等[4]對(duì)人源街毒株HN10進(jìn)行過(guò)全基因組測(cè)序及特征分析。
尸檢是狂犬病確診的方法之一，而與國(guó)外相比，國(guó)內(nèi)狂犬病患者或疑似狂犬病患者死亡后，尸檢和病因鑒定較少。本研究對(duì)2013年武漢市新發(fā)生的一例疑似狂犬病死亡病例取尸體腦組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，采用直接熒光抗體法（DFA）和ELISA法檢測(cè)RABV抗原，對(duì)分離的病毒全基因組進(jìn)行測(cè)序，并在分子水平與國(guó)內(nèi)外的疫苗株及近期湖北省及周邊地區(qū)的街毒株進(jìn)行遺傳特征差異和系統(tǒng)進(jìn)化分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 病史資料 本案例屬于一犬咬多人。死者邱某，男，37歲，于2013年3月12日在武漢市青山區(qū)建設(shè)十路被犬咬傷下嘴唇，Ⅲ級(jí)暴露；同行者石某，男，48歲，手臂也被此犬咬傷，Ⅲ級(jí)暴露。暴露后二人馬上“肥皂水沖洗，擠壓出血”處理傷口，傷人犬已被處死[5]。
2013年3月26日晚（暴露后第15天）邱某突發(fā)嘔吐、舌頭打卷、吐口水、怕風(fēng)恐水，截止發(fā)病時(shí)已接種疫苗4針；后轉(zhuǎn)至武漢市急救中心救治，3月29日9時(shí)45分，邱某死亡。石某分別于暴露后第0、3天各接種2針，第7、14、28天各接種1針，共接種7針狂犬病疫苗，至今存活。二者均未注射抗血清或免疫球蛋白。同濟(jì)法醫(yī)學(xué)司法鑒定中心分離死者邱某人腦組織，委托武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司狂犬病檢測(cè)中心（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“本中心”）進(jìn)行檢測(cè)，分離的狂犬街毒株命名為13WH10。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)1日齡昆明乳鼠5只，由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(鄂）2008-0003。
1.3 主要試劑 RABV抗原檢測(cè)試劑盒(雙抗體夾心ELISA)由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗RABV核蛋白單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Millipore公司，TRIzol試劑和superscript ⅢReverse Transcriptase購(gòu)自美國(guó)lnvitrogen公司，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、EXTaq酶和pMDl9-T simple vector 試劑盒購(gòu)于日本TAKARA，凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit購(gòu)于德國(guó)Qiagen公司。
1.4 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)人用狂犬病疫苗PV株（Genbank accession no. M13215）基因組序列，并參考表1中RABV株的保守區(qū)序列，使用PrimerPremier 5軟件設(shè)計(jì)12對(duì)引物，見(jiàn)表2，覆蓋全基因組序列。
1.5 RABV抗原鼠腦傳代 取死者腦樣品海馬回部位組織 0.3 g，加入含青霉素(500 U／ml)及鏈霉素(2 mg／ml)的PBS(pH 7.4)，研磨制備成10％的腦懸液，顱內(nèi)接種1日齡昆明乳鼠5只,每只10μl，連續(xù)21天觀察乳鼠發(fā)病情況[6] 。
1.6 RABV抗原的檢測(cè)
1.6.1 DFA檢測(cè) 取死者腦樣品海馬回部位組織及RABV傳代乳鼠腦組織印片于載玻片上，冷丙酮室溫固定30min，干燥后加入FITC標(biāo)記的抗RABV核蛋白單克隆抗體（1：60稀釋?zhuān)?/span>37℃濕盒孵育1 h，PBS漂洗3次，晾干后滴加60％甘油，蓋玻片封片，于熒光顯微鏡下觀察[7]。
1.6.2 雙抗體夾心ELISA檢測(cè) RABV抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)死者腦組織和上述接種死者腦海馬組織懸液后發(fā)病的乳鼠腦組織懸液中的RABV抗原[8]。以正常乳鼠腦組織作為陰性對(duì)照，CVS-24標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒接種的乳鼠腦組織作為陽(yáng)性對(duì)照。
在陰性對(duì)照孔A450值 < 0.1、陽(yáng)性對(duì)照孔A450值 > 0.5的條件下，樣品A450值 > 0.4 判定為RABV抗原陽(yáng)性。
1.7 全基因組分段PCR擴(kuò)增
用TRIzol試劑提取病毒RNA，以pd(N)6為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成病毒基因組cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，用表2中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：TAKARA Ex Taq 0.26 ul，10×Ex Taq buffer 5 ul，dNTP Mixture 4 ul，模板1 ul，正反向引物各1 ul，去離子水37.74 ul，共50ul。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％凝膠電泳鑒定，然后用QIAquickGel Extraction Kit 回收。
表1. 本研究中參考的狂犬病街毒株及疫苗株
Table 1. RABV street strains and vaccine strains refered in thisstudy
|
病毒株 |
宿主/用途 |
分離地 |
分離時(shí)間 （年） |
Gene序列號(hào)
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|
標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株 |
法國(guó) |
1882 |
GQ918139 |
GQ918139 |
|
ERA |
獸用疫苗株 |
美國(guó) |
1935 |
EF206707 |
EF206707 |
|
SAD B19 |
人用疫苗株 |
美國(guó) |
1935 |
M31046 |
M31046 |
|
RC-HL |
人用疫苗株 |
日本 |
- |
AB009663 |
AB009663 |
|
HEP-Flury |
人用/獸用疫苗株 |
美國(guó) |
1939 |
AB085828 |
AB085828 |
|
PV |
人用疫苗株 |
法國(guó) |
1882 |
M13215 |
M13215 |
|
CTN-1 |
人用疫苗株 |
中國(guó)山東 |
1956 |
FJ959397 |
FJ959397 |
|
3aG |
犬 |
中國(guó)北京 |
1935 |
AF155039 |
L04522 |
|
HN10 |
人 |
中國(guó)湖南 |
2007 |
EU643590 |
EU643590 |
|
HN06 |
犬 |
中國(guó)湖北武漢 |
2005 |
- |
DQ849062 |
|
WH5 |
犬 |
中國(guó)湖北武漢 |
2005 |
EU159380 |
DQ849061 |
|
QC |
人 |
中國(guó)湖北蘄春 |
2006 |
EU159377 |
DQ849063 |
|
WHQS |
犬 |
中國(guó)湖北武漢 |
2007 |
- |
FJ602454 |
|
WHWD |
犬 |
中國(guó)湖北武漢 |
2007 |
- |
FJ602455 |
|
WHYF |
犬 |
中國(guó)湖北武漢 |
2007 |
- |
FJ602456 |
|
WH11 |
驢 |
中國(guó)湖北武漢 |
2011 |
JQ647510 |
JQ647510 |
|
04030PHI |
人 |
菲律賓 |
2004 |
EU086205 |
EU086155 |
|
H-08-1320 |
人 |
斯里蘭卡 |
2008 |
AB569299 |
AB569299 |
|
NNV-RAB-H |
人 |
印度 |
2006 |
EF437215 |
EF437215 |
|
Hum-Trans-IND |
人 |
德國(guó)(來(lái)自印度) |
2004 |
AY956319 |
AY956319 |
|
8743THA |
人 |
泰國(guó) |
1983 |
EU293121 |
EU293121 |
|
8764THA |
人 |
泰國(guó) |
1983 |
EU293111 |
EU293111 |
注：RC-HL株未查到確切分離時(shí)間
1.8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆和序列測(cè)定 將PCR回收純化產(chǎn)物與pMDl9-Tsimple vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5a（pMDl9-Tsimple vector自帶），篩選鑒定陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，送南京金斯瑞公司測(cè)序。
1.9 序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件包中MegAlign模塊對(duì)基因所編碼的氨基酸進(jìn)行對(duì)位分析；ClustalX 1.83軟件和GENEDOC軟件用于序列比對(duì)；MEGA 4.1軟件以Kimura two- parameter模型鄰位相連法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap-l000)，并與國(guó)內(nèi)外疫苗株及近期湖北省及周邊地區(qū)分離的代表性街毒株（表1）進(jìn)行同源性分析。
表2 狂犬病病毒街毒株13WH10全基因組測(cè)序引物
Table 2. Primersused for sequencing of the complete genome of rabies virus isolate 13WH10
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Sequence (5’-3’) |
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Length (bp) |
Position |
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RV1-F |
ACGCTTAACAACAAAAYCATAGAAGAAGCAG |
|
1012 |
1-1012 |
|
RV1-R |
AAAGTGAATGAGATTGAACACGTGACCAAC |
|
|
|
|
RV2-F |
GCTTACGAAGATTGCTCAGGACTGGTATCA |
|
951 |
764-1714 |
|
RV2-R |
TTAAGGCCAGATGGTTTTCCGTCATCCAGC |
|
|
|
|
RV3-F |
TAACACCCCTCCTTTTGAACCAT |
|
1005 |
1484-2488 |
|
RV3-R |
GTGGTGTTGCCTGTTTTTTTCAT |
|
|
|
|
RV4-F |
CAGGCAACACCACTGATAAAATGAA |
|
678 |
2476-3153 |
|
RV4-R |
TCTCTCCTCCAGAGGTAAACAAGTG |
|
|
|
|
RV5-F |
TGGTGTATCAACATGAATTC |
|
1097 |
3000-4096 |
|
RV5-R |
ACCCATGTTCCG TCCATAAG |
|
|
|
|
RV6-F |
TGTGACATTTTCACCAATAGTAGAGGGAAG |
|
1419 |
3937-5355 |
|
RV6-R |
TTTTTTTCTCGACTGAAAAGCGTAGATGAC |
|
|
|
|
RV7-F |
TCCAAGAACTGATACCAAAGGTGGTGGACA |
|
1396 |
5115-6510 |
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RV7-R |
ACATCCGTACACAAAAACCAGGTCATGTAT |
|
|
|
|
RV8-F |
AGAGGGCAGAGAAGTTTAGACCTCTTATTC |
|
1360 |
6341-7700 |
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RV8-R |
CGGTATATAGAAAGGGCATTCCTMGATATG |
|
|
|
|
RV9-F |
TTAYGCCAAAARGGCTGGAGTCTGGTCAGC |
|
1400 |
7501-8900 |
|
RV9-R |
CCTTTTAGAGGGCCTCGTGAAAAAAATGAC |
|
|
|
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RV10-F |
GCAGATCTCTTAAGAGAGATTTCTTGGGGG |
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1410 |
8701-10110 |
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RV10-R |
TCGTAGGTTAGCTCTCATGCTCTTAGATAR |
|
|
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|
RV11-F |
CTATTTTGTGTTACCTCCARCATGTGCTGC |
|
1110 |
9911-11020 |
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RV11-R |
GGAGATATAGYTCAGATGAAAAAGACGAGG |
|
|
|
|
RV12-F |
CGGATAACACTkTTGATGTCTGACTTCGCA |
|
1094 |
10831-11924 |
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RV12-R |
ACGCTTAACAAAAAAACAATAAAGACAAAAA AAATAATCAAACAACCAGAGGTTCTG |
|
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|
2 結(jié) 果
2.1 乳鼠發(fā)病情況 1日齡昆明乳鼠接種死者腦組織懸液12d后開(kāi)始表現(xiàn)出拱背、聳毛、轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)、麻痹等狂犬病癥狀，并于發(fā)病后2~3d內(nèi)全部死亡。
2.2 RABV抗原檢測(cè)結(jié)果
2.2.1 DFA法 熒光顯微鏡下觀察顯示，死者腦組織樣本均可見(jiàn)不同形狀和大小的綠色熒光顆粒，見(jiàn)圖1，表明RABV抗原陽(yáng)性。
2.2.2 ELISA法 檢測(cè)結(jié)果顯示，死者腦組織樣本A450值為1.616，陽(yáng)性對(duì)照2.346，
陰性對(duì)照0.087，表明該樣本RABV抗原陽(yáng)性；5只傳代乳鼠腦組織的A450值分別為2.127、2.556、2.345、2.170、2.237，陽(yáng)性對(duì)照2.259，陰性對(duì)照0.065，表明該樣本的RABV可在乳鼠腦組織中傳代。
A:
B:
A：病人腦組織； B：CVS-24標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株接種乳鼠腦組織；
C：傳代的乳鼠腦組織； D：正常乳鼠腦組織。
圖1 人腦組織樣本 RABV DFA檢測(cè)(40×)
Fig.1 DFA detection of RABV antigen in human brain tissue sample(40×)
2.3 13WH10街毒株全基因組測(cè)序結(jié)果分析 13WH10街毒株基因組全長(zhǎng)11,924bp，與Genbank公布的其他狂犬病病毒基因組類(lèi)似。3’端58個(gè)核苷酸先導(dǎo)序列，N基因（59-1483），P基因（1486-2475），M基因（2481-3283），G基因（3289-5355），L基因（5380-11,854），5，端70個(gè)核苷酸尾巴。5種結(jié)構(gòu)蛋白CDS編碼區(qū)序列如下：1353nt N 蛋白（71-1353），894 nt P 蛋白（1515-2408），609 nt M 蛋白（2496-3104），1575ntG 蛋白（3316-4890），6385nt L蛋白（5407-11793）。
2.4 13WH10街毒株N、G基因與國(guó)內(nèi)外疫苗株及近期湖北省周邊地區(qū)分離的代表性街毒株的同源性分析 13WH10分離株N基因開(kāi)發(fā)閱讀框（ORF）全長(zhǎng)為1353bp，編碼450個(gè)氨基酸的核蛋白。利用核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖2，圖中顯示，13WH10分離株與湖北省內(nèi)分離株QC、WH11等親緣關(guān)系較近，處于同一亞群。13WH10與近年在湖北省及周邊地區(qū)分離的代表性街毒株N 基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為 88.8%～99.6% 和 99.1%～100%，國(guó)內(nèi)外人用、獸用疫苗株N 基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為 86.2%～89.5% 和95.6%～99.1%，東南亞分離街毒株N 基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為 86.6%～88.9%和 98%～99.3%。
注： 13WH10為本研究分離株
圖2 狂犬病病毒13WH10株 N 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析
Fig.2 Phylogenetic tree was constructed using the nucleotidesequences of nucleoprotein gene of rabies virus isolate 13WH10 (marked with redtriangle)
G 基因ORF全長(zhǎng)1575bp，編碼524個(gè)氨基酸，利用核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖3），結(jié)果顯示，13WH10與湖北省內(nèi)分離株WHWD、QC、WH11等親緣關(guān)系較近，處于同一亞群。13WH10與近年在湖北省及周邊地區(qū)分離的代表性街毒株G 基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為87.8%～99.6%和99%～99.6%，國(guó)內(nèi)外人用、獸用疫苗株G 基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為82.2%～87.5% 和 87.8%～94.7%，東南亞國(guó)家分離街毒株G 基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性分別為83.8%～87.6%和92.6%～94.5%。
N、G基因的進(jìn)化樹(shù)分析均顯示，13WH10與CTN-1同源性高，與國(guó)外疫苗株相比，與東南亞地區(qū)的街毒株同源性較歐美國(guó)家高；而中國(guó)北京分離的3aG株與國(guó)外的疫苗株同源性較高，處于另一亞群。
注： 13WH10為本研究分離株
圖3 狂犬病病毒13WH10株 G 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析
Fig.3 Phylogenetic treewas constructed using the nucleotide sequences of glycoprotein gene of rabiesvirus isolate 13WH10 (marked with red triangle).
3 討 論
3.1 本病例接種疫苗仍造成死亡的原因 造成本病例死亡的主要原因是“未注射抗血清”。
WHO和我國(guó)衛(wèi)生部頒布的狂犬病暴露后處置規(guī)范明確規(guī)定，被瘋動(dòng)物Ⅲ級(jí)致傷者必須徹底清洗傷口、特異性抗體制劑聯(lián)合疫苗接種進(jìn)行暴露后治療[9]。疫苗接種即使使用高質(zhì)量的細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，初次免疫后的有效中和抗體也要在免疫后7d左右產(chǎn)生，疫苗免疫后尚未產(chǎn)生中和抗體的這一“空缺”時(shí)間，只有應(yīng)用特異性抗體制劑才能予以填補(bǔ)，這一重要問(wèn)題經(jīng)過(guò)人體觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已得到充分證實(shí)[1，10]。本案例中邱某的暴露部位是下嘴唇，石某的暴露部位是手臂。狂犬病病毒的入侵部位與發(fā)病率密切相關(guān)，暴露部位距離大腦越近，潛伏期越短，發(fā)病率越高，Dean等[11]將狂犬病病毒Flury Lep株接種狐貍頸部和腿部肌肉的研究得到了證實(shí)。此外，二人進(jìn)行傷口處理時(shí)采用的“擠壓出血”方法，不符合WHO和我國(guó)衛(wèi)生部頒布的狂犬病暴露后處置規(guī)范，應(yīng)立即用肥皂水、清潔劑、碘或其他對(duì)狂犬病病毒有效的殺滅物質(zhì)徹底沖洗傷口至少15分鐘，隨后再進(jìn)行免疫球蛋白等處理。及時(shí)徹底清洗傷口、接種狂犬病疫苗與抗血清能有效預(yù)防暴露后狂犬病的發(fā)生[9]。擠壓出血方法可能導(dǎo)致傷口破壞程度更嚴(yán)重，更易使狂犬病毒進(jìn)入傷口周?chē)?xì)胞及神經(jīng)組織。
3.2 本病例確診為狂犬病的依據(jù)
根據(jù)《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)校準(zhǔn)：狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)》（衛(wèi)生部2008年版），狂犬病的臨床診斷病例必須加上至少一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果才可確診。DFA（直接免疫熒光法）是WHO推薦的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)狂犬病的金標(biāo)準(zhǔn)[7]。雙抗體夾心ELISA法以核蛋白單克隆抗體為基礎(chǔ)，具有較高的敏感性，操作簡(jiǎn)便、結(jié)果易于判定，廣泛應(yīng)用于狂犬病的輔助診斷。上述腦組織樣品用DFA和雙抗體夾心ELISA兩種方法鑒定，均為狂犬病病毒抗原陽(yáng)性，因此本病例可確診為狂犬病。后續(xù)的病毒分離和全基因組測(cè)序分析等方法則可進(jìn)一步確證本病例的診斷。
3.3 狂犬病病毒13WH10株的系統(tǒng)進(jìn)化特征
本研究成功從人腦樣品分離出狂犬病病毒13WH10株，并完成全基因測(cè)序及特征分析。目前，已有多株疫苗株SAD B19，CTN-1，RC-HL，RV-97等及街毒株HN10，WH11，RRV-ON-99-2，KGH等完成全基因測(cè)序分析工作。上述大量研究及本研究結(jié)果顯示，狂犬病病毒屬基因組高度保守，存在大量與病毒在宿主體內(nèi)繁殖擴(kuò)增相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)基序。13WH10與國(guó)內(nèi)外疫苗株及周邊地區(qū)街毒株的同源性分析結(jié)果顯示，各病毒株基因組同源性較高，說(shuō)明狂犬病病毒具有較高的遺傳穩(wěn)定性。疫苗株與其系統(tǒng)進(jìn)化相近的街毒株大多存在少量核苷酸替換，良好的疫苗株應(yīng)該與流行區(qū)域的街毒株具有高水平的同源性。
N、G 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果均顯示，13WH10與湖北省及周邊街毒株（WH11，QC等）處于同一亞群，與CTN-1同源性高，與國(guó)外病毒株相比，其與東南亞地區(qū)的病毒株同源性較歐美國(guó)家高；而中國(guó)北京分離的3aG株與國(guó)外的疫苗株同源性較高，處于另一分支。病毒株親緣關(guān)系的密切程度，與病毒的分離地點(diǎn)、宿主來(lái)源等密切相關(guān)，分離地越近，宿主來(lái)源種屬越接近，則同源性越高[12]。CTN-1與國(guó)內(nèi)分離街毒株的同源性較高，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系也較近，提示采用CTN-1疫苗株生產(chǎn)的狂犬病疫苗能有效預(yù)防中國(guó)狂犬病的流行[13]。ZhangYZ等人認(rèn)為，中國(guó)狂犬病街毒株可分為兩大分支：大多數(shù)中國(guó)街毒株集中在一亞群，與CTN及東南亞國(guó)家分離株高度同源，而另一部分中國(guó)街毒株與3aG及國(guó)外疫苗株同源性較高，可歸為另一亞群[3]。3aG株及國(guó)外疫苗株可能與我國(guó)數(shù)年前街毒株的流行趨勢(shì)趨同。孟勝利等[14]的研究表明RABV存在著跨地域、跨宿主傳播的現(xiàn)象。Fèvre EM等[15]的研究表明，野生動(dòng)物和家養(yǎng)動(dòng)物的貿(mào)易、遷移對(duì)病毒類(lèi)疾病的傳播有重要影響。
3.4 應(yīng)倡導(dǎo)與狂犬病相關(guān)的尸檢
由于傳統(tǒng)觀念或是其他因素，中國(guó)目前死亡病人的尸檢率極低。20%的狂犬病人癥狀不典型，易誤診為其他腦炎，而腦炎病人的死因幾乎都沒(méi)有經(jīng)過(guò)針對(duì)狂犬病的尸檢進(jìn)行確診。狂犬病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)腦組織進(jìn)行特異性熒光抗體檢測(cè)。因此，尸檢后取腦組織的實(shí)驗(yàn)室檢查是狂犬病確診的最好方法。因供體攜帶狂犬病病毒通過(guò)角膜移植引起受體狂犬病死亡的病例已出現(xiàn)多起[16-17]。2004年美國(guó)一男子生前被蝙蝠咬傷，死后將腎臟、肝臟等移植給4位受者，4位患者均因狂犬病死亡[18]。雖然我國(guó)目前未報(bào)導(dǎo)因器官移植引發(fā)狂犬病的案例，但應(yīng)當(dāng)引以為戒：對(duì)與腦炎相關(guān)的各種死因，應(yīng)逐步推廣進(jìn)行針對(duì)狂犬病的尸檢鑒定，以使我國(guó)有關(guān)狂犬病的死亡人數(shù)統(tǒng)計(jì)更加準(zhǔn)確可靠。
目前全球已發(fā)現(xiàn)14種基因型的RABV，新的基因型病毒還在不斷發(fā)現(xiàn)。我國(guó)RABV的流行情況非常復(fù)雜且特殊，需在更大范圍內(nèi)系統(tǒng)地開(kāi)展狂犬病的分子流行病學(xué)研究，分析RABV街毒株與疫苗株之間的關(guān)系、抗原性之間的差異、及時(shí)監(jiān)測(cè)病毒株的變異情況，以及RABV在不同宿主之間的跨種傳播和跨地區(qū)傳播的模式。
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